CRM系统:白喉毒素无毒变异体CRM197 的表达及其载体作用
白喉毒素无毒变异体CRM197 的表达及其载体作用
王春娥叶强李凤祥
【摘要】目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197, 并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21
( DE3) 中表达CRM197, 用金属镍离子亲和层析纯化; 以重组CRM197 为蛋白载体, 在EDAC 的作用下, 与活化的A 群脑膜炎球菌
荚膜多糖( GAMP) 结合, 制备GAMP-rCRM197 结合物, 免疫BALB / c 小鼠, 间接ELISA 法测定血清中A 群脑膜炎球菌多糖特异
性IgG 抗体, 并分析其免疫原性。结果重组CRM197 在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达, 表达量占菌体总蛋白的25%左右;
Western blot 证明重组CRM197 具有良好的反应原性; 各针接种后, 结合物诱生的多糖特异性IgG 水平均显著高于GAMP 组和
GAMP + rCRM197 混合物组, 具有较强的免疫原性; 多次接种产生了免疫增强效应, 重组CRM197 具有载体蛋白的作用。结论已
在大肠杆菌BL21( DE3) 中成功表达了重组CRM197, 以纯化的重组CRM197 作为载体制备的GAMP-rCRM197 结合物具有良好的免
疫原性, 为以重组CRM197 为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。
【关键词】白喉毒素; 无毒变异体; CRM197; 载体蛋白; 结合疫苗; A 群脑膜炎球菌
Expr ession of Nontoxic Diphther ia Toxin Mutant CRM197 as A Car r ier Protein
WANG Chun-e, YE Qiang, LI Feng-xiang ( National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological
Products, Beijing 100050, China)
【Abstr act】Objective To express the nontoxic mutant CRM197 of diphtheria toxin and study its effect as a carrier protein.
Methods Express CRM197 in E. coli BL21 ( DE3) by gene engineering technique and purify the expressed product by nickel ion
affinity chromatography. Link the purified CRM197 as a carrier protein to activated group A meningococcal polysaccharide( GAMP) ,
using EDAC as linker. Immunize BALB / c mice with the prepared GAMP- CRM197 conjugate and determine the specific IgG against
GAMP in sera by indirect ELISA. Results Recombinant CRM197 was expressed in E. coli mainly in a form of inclusion body. The
expressed product contained about 25% of total somatic protein and showed good reactogenicity as proved by Western blot. The IgG
level against GAMP induced by GAMP- CRM197 conjugate was significantly higher than those by GAMP and by the mixture of GAMP
and rCRM197. Repeated immunization with the conjugate induced immunopotentiation, indicating the effect of CRM197 as a carrier protein.
Conclusion Recombinant CRM197 was successfully expressed in E. coli, and the GAMP-rCRM197 conjugate prepared with the
purified expressed product showed good immunogenicity. It laid an experimental foundation of preparation of other conjugate vaccine
using CRM197 as a carrier protein.
【Key words】Diphtheria toxin; Nontoxic mutant; CRM197; Carrier protein; Conjugate vaccine; Group A meningococcus
国际上应用的载体蛋白主要有4 种: 破伤风类
毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒变异体CRM197
和B 群脑膜炎球菌外膜蛋白复合体。而国内研制的
结合疫苗多采用破伤风类毒素[ 1~3 ] , 此类结合疫苗
虽然具有较好的免疫效果, 但破伤风毒素相对分子
质量较大, 致敏性较强, 且存在毒性回复的危险。使
用无毒性的蛋白十分有必要。CRM197 为白喉毒素的
无毒变异体, 经研究证明其免疫原性与白喉毒素几
乎无差别[ 4, 5 ] , 作为载体蛋白在国外已得到广泛应
用[ 6~8] 。目前, 国内尚未见以CRM197 为载体的结合疫
苗研制的报道。本研究根据国内外CRM197 的研究情
况及国内脑膜炎球菌结合疫苗的研制现状, 采用基
因工程技术在大肠杆菌中表达crm197 基因, 并对表
达产物进行纯化, 以其作为蛋白载体, 制备了A 群脑
膜炎球菌结合物, 并初步研究了结合物的免疫原性。
1. 材料与方法
1. 1 菌株及质粒
白喉棒状杆菌C7( β197) 菌株( ATCC53281) 购自
ATCC; pCR 2.1-TOPO 质粒和感受态大肠杆菌TOPO10
购自Invitrogen 公司; 质粒pET-28a 和大肠杆菌BL21
( DE3) 由本室保存。
1. 2 试剂
Ex Taq 酶、DNA marker 和凝胶回收试剂盒均购
自宝生物工程( 大连) 有限公司; 质粒小量提取试剂
盒购自上海华舜公司; 限制性内切酶购自纽英伦生
物技术( 北京) 有限公司; 蛋白质低相对分子质量标
准购自BIO-RAD 公司; Chelating SepharoseTM Fast
Flow 和Sepharose 4 Fast Flow 购自GE Healthcare;
HRP 标记的兔抗马IgG 购自北京欣经科公司; 白喉
絮状反应抗毒素国家标准品( 1000Lf) 由本所血清室
提供, 批号0048; A 群脑膜炎球菌荚膜多糖( GAMP) ,
批号20050201, 由云南沃森生物技术有限公司提供;
A群流脑诊断血清国家参考品, 批号2003, 效价1∶320,
由本室保存; CRM197 阳性对照( 1 mg) 、溴化氰( CNBr) 、
1, 6-己二酰肼( ADH) 、碳二亚胺( EDAC) 和2, 4, 6-三
硝基苯磺酸( TNBS) 均购自Sigma Aldrich 公司; 辣根
过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG 为北京中杉金桥生
物技术有限公司原装进口分装产品。
1. 3 实验动物
SPF 级BALB / c 小鼠, 体重18 ~ 20 g, 雄性, 由
本所实验动物中心提供。
1. 4 PCR 引物设计及合成
参考GenBank 中白喉毒素的编码基因序列( 收
录号为K01722) [ 9] , 用引物设计软件Oligo 6. 0 设计
引物, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列如下: 上游: 5′-CGCATATGGGCGCTGATG
ATGTTGTT- 3′( 引入NdeⅠ酶切位点) ; 下游: 5′-AT
GGATCCCGACCCCACTACCTTTCC-3′( 引入BamHⅠ
酶切位点) 。
1. 5 目的基因的扩增及克隆
提取白喉棒状杆菌C7( β197) 基因组DNA 作为
模板, 扩增目的基因。反应条件为: 94℃预变性5min;
94℃ 30 s, 55℃ 退火1 min, 72℃ 延伸1. 5 min, 共30
个循环; 最后72℃延伸10 min。1% 琼脂糖凝胶电泳
分析扩增片段的大小, 凝胶回收试剂盒回收目的片
段, 连接于pCR 2. 1-TOPO 载体, 转化感受态大肠杆
菌TOP10, 挑选阳性克隆, 提取质粒, 经NdeⅠ 和
BamHⅠ双酶切鉴定后, 将阳性克隆送上海生工生物
工程技术服务有限公司进行序列测定。
1. 6 重组表达载体的构建
将测序正确的阳性克隆提取质粒, 与pET-28a
质粒分别用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切, 凝胶回
收相应片段, 连接后, 转化感受态大肠杆菌BL21( DE3) ,
筛选阳性克隆, 提取质粒, 进行双酶切鉴定。
1. 7 重组CRM197 的诱导表达
将含有阳性重组质粒的大肠杆菌, 在37℃,
0. 2 mmol /L IPTG 的条件下诱导表达4 h, 离心收集
菌体, 超声破碎, 分析重组CRM197 表达形式。
1. 8 重组CRM197 的纯化
将包涵体分别用含1% Triton X-100 的Tris 缓
冲液( pH 8. 5) 和含2 mol / L 尿素的PBS 缓冲液
( pH 7. 4) 洗涤, 进行初步纯化, 最后将包涵体沉淀用
含35 mmol / L 咪唑和8 mol / L 尿素的缓冲液溶解,
4℃, 12 000 r /min 离心20 min, 取上清, 加样于金属
螯合亲和层析柱, 用含250 mmol /L 咪唑的缓冲液洗
脱。收集洗脱液, 进行SDS-PAGE 分析, 凝胶成像分
析蛋白纯度。将纯化后的重组蛋白以梯度透析法除
去尿素和咪唑。
1. 9 重组CRM197 的鉴定
将纯化后的重组CRM197 和阴性对照样品[ pET-
28a /BL21( DE3) ] 经SDS-PAGE 后, 用半干胶转移仪
转移至PVDF 膜, 以白喉抗毒素( 马血清) 为一抗,
HRP 标记的兔抗马IgG 为二抗, 进行Western blot 检
测。
1. 10 GAMP-重组CRM197 结合物的制备
参考文献[ 1~3, 10] 进行。将GAMP( 6 mg /ml) 用
0. 1 mol /LNaOH 调pH 至10. 5 ±0. 2; 以0. 5 mg /mg
GAMP 的比例缓慢加入CNBr, 并使pH 稳定在10. 5 ±
0. 2, 室温搅拌反应6 min; 加入与多糖等体积的
0. 5 mol / L ADH ( 预先溶解于0. 5 mol / L NaHCO3
中) , 用0.1mol/LHCl 调整pH 稳定在8.5 ±0.2, 室温搅
拌反应20 min; 反应体系于3 ~8℃搅拌反应12 h 以
上后, 透析除去游离的CNBr 和ADH, 测定衍生物的
ADH 及O-乙酰基含量。
将衍生物与等量重组CRM197 混合, 用0. 1 mol /L
HCl 调整pH 为6. 0 ~6. 2, 加入EDAC 粉末至终浓度
为0. 1 mol / L, 并维持pH 为6. 0 ~6. 2, 室温搅拌反
应2 h; Sepharose 4 Fast Flow( XK 1. 6 cm ×90 cm) 层
析柱进行凝胶过滤纯化, 同时监测206 nm、280 nm
波长处的吸光度值。
1. 11 结合物的检测
1. 11. 1 生化检测: ADH 含量测定采用TNBS 法; O-
乙酰基含量测定采用Herstrin 法; 蛋白质含量测定
采用Lowry 法; 磷含量测定采用改良Chen 法; EDAC
残留量按常规方法进行。
1. 11. 2 抗原性检测: 采用免疫双扩散法, 按照《中
国药典》三部( 2005 版) 方法进行。
1. 11. 3 免疫原性检测: 将144 只雄性BALB / c 小
鼠随机分为4 组, 每组36 只, 分别为:A 组:GAMP 组;
B 组: GAMP + rCRM197 混合物组; C 组: GAMPrCRM
197 结合物组; D 组: 生理盐水对照组。
皮下接种, 剂量为0. 2 ml / 只, 前3 组分别含多
糖2. 5 μg, 于第0、14、28 天接种, 第14、28、35 天眼
眶采血。离心收集血清, 用间接ELISA 方法测定血
清中多糖特异性IgG 抗体。以阴性对照血清平均吸
光度值的2. 1 倍作为Cutoff 值, 以吸光度> Cutoff
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